培養基在制備后的24h內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。
　　高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥。關閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時，開始計時，維持壓力0.1～0.15MPa，20min。到達保壓時間后，即可切斷電源，在壓力降到0.5MPa，可緩慢放出蒸氣，應注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。當壓力降到零后，才能開蓋，取出培養基，擺在平臺上，以待冷凝。
　　對高壓滅菌后不變質的物品，如無菌水、栽培介質、接種用具，可以延長滅菌時間或提高壓力。而培養基要嚴格遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止培養基中的成分變質或效力降低，不能隨意延長時間。對于一些布制品，如實驗服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20～30min。
　　高壓滅菌前后的培養基，其pH值下降0.2～0.3單位。高壓滅菌后培養基pH值的變化方向和幅度取決于多種因素。培養基中成分單一時和培養基中含有高或較高濃度物質時，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大。高壓滅菌通常會使培養基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內，高壓滅菌后的培養基約升高0.43倍。培養基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15%～25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養基值小于5.5，其水解量更多，培養基中添加0.1%活性炭時，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。
為防止高壓滅菌產生的上述一些變化可用下列方法
(1) 經常注意搜集有關高壓滅菌影響培養基成分的資料，以便及時采取有效措施。
(2) 設計培養基配方時盡量采用效果類似的穩定試劑并準確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1％以下)注意pH值對高壓滅菌下培養基中成分的影響等。
(3) 配制培養基時應注意成分的適當分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。
(4) 注意高壓滅菌后培養基pH值的變化及回復動態。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。這樣在實驗中就可以根據這一規律加以掌握。